Медицинская биология. Методы генетики Использование цитогенетического метода

Цитогенетический метод

Идеограмма хромосом.

Идиограмма - графическое изображение отдельных хромосом со всеми их структурными характеристиками.

Генетика соматических клеток.

С помощью этих методов изучают наследственность и изменчивость соматических клеток, что в значительной мере компенсирует невозможность применения к человеку метода гибридологического анализа.

Методы генетики соматических клеток, основанные на размножении этих клеток в искусственных условиях, позволяют не только анализировать генетические процессы в отдельных клетках организма, но благодаря полноценности наследственного материала, заключенного в них, использовать их для изучения генетических закономерностей целостного организма.

В связи с разработкой в 60-х гг. XX в. методов генетики соматических клеток человек оказался включенным в группу объектов экспериментальной генетики. Благодаря быстрому размножению на питательных средах соматические клетки могут быть получены в количествах, необходимых для анализа. Они успешно клонируются, давая генетически идентичное потомство. Разные клетки могут, сливаясь, образовывать гибридные клоны. Они легко подвергаются селекции на специальных питательных средах и долго сохраняются при глубоком замораживании. Все это позволяет использовать культуры соматических клеток, полученные из материала биопсий (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбрионов, клетки из околоплодной жидкости), для генетических исследований человека, в которых используют следующие приемы: 1) простое культивирование, 2) клонирование, 3) селекцию, 4) гибридизацию.

Культивирование позволяет получить достаточное количество клеточного материала для цитогенетических, биохимических, иммунологических и других исследований.

Планирование - получение потомков одной клетки; дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов.

Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора мутантных клеток с определенными свойствами и других клеток с интересующими исследователя характеристиками.

Гибридизация соматических клеток основана на слиянии совместно культивируемых клеток разных типов, образующих гибридные клетки со свойствами обоих родительских видов. Для гибридизации могут использоваться клетки от разных людей, а также от человека и других животных (мыши, крысы, морской свинки, обезьяны, джунгарского хомячка, курицы).

Гибридные клетки, содержащие два полных генома, при делении обычно «теряют» хромосомы предпочтительно одного из видов. Например, в гибридных клетках «человек - мышь» постепенно утрачиваются все хромосомы человека, а в клетках «человек - крыса» - все, кроме одной, хромосомы крысы, с сохранением всех хромосом человека. Таким образом можно получать клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность изучать сцепление генов и их локализацию в определенных хромосомах.

Постепенная потеря хромосом человека из гибридных клеток параллельно с изучением ферментов дает возможность судить о локализации гена, контролирующего синтез данного фермента, в определенной хромосоме.

Благодаря методам генетики соматических клеток можно изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Они позволяют судить о генетической гетерогенности наследственных болезней, изучать их патогенез на биохимическом и клеточном уровнях. Развитие этих методов определило возможность точной диагностики наследственных болезней в пренатальном периоде.

Цитогенетический метод используется для диагностики пола и анализа хромосомных заболеваний.

Диагностика пола производится с помощью анализа Х-хроматина в клетках крови или буккального эпителия. Х-хромосома образует, так называемое, тельце Барра, У-хромосома — F-тельце.

Для анализа хромосомных аномалий используют различные методы окраски:

рутинная окраска — дает возможность выявить нарушения числа хромосом, т.к. они окрашиваются в равномерно черный цвет.

дифференциальные методы дают возможность окрасить хромосомы неравномерно, выделяя светлые и темные участки. При таком окрашивании можно выявить не только числовые нарушения, но и структурные изменения хромосом.

Показания для использования цитогенетического метода:

1.Если при клиническом обследовании у пробанда обнаружены признаки хронических болезней, но диагноз не установлен.

2.При диагностике наследственных болезней, характеризующихся хромосомной нестабильностью.

3.При определении прогноза потомства, если в родословной имеются лица с хромосомными болезнями.

4.При многократных спонтанных абортах, мертворождениях и наличии нескольких детей с врожденными пороками развития.

5.У женщин с нарушением репродуктивной функции неясного генеза.

Биохимический метод используется для:

установления дифференцированного диагноза заболевания

выявления гетерозиготности

в дородовой диагностике

С его помощью выясняют нарушения обмена. Показания к биохимическим исследованиям:

умственная отсталость

нарушение психического статуса

нарушение физического развития костей туловища и конечностей, снижение слуха, зрения, ожирение

непереносимость отдельных продуктов и лекарств

Амниоцентез — метод забора и исследования околоплодной жидкости. Используется в пренатальной (дородовой) диагностике. Амниоцентез производят после предварительного УЗ-исследования с помощью которого определяют положение плаценты, срок беременности, исключают грубые пороки развития плода. Амниоцентез производят, как правило, трансабдоминально (прокол передней брюшной стенки). С помощью данного метода определяют:

пол плода. Для этого берут 2-5 мл околоплодной жидкости. После центрифугирования осадок, содержащий слущенные клетки эпителия плода, микрос-копируют для выявления Х- и У-хроматина

кариотип плода. Это дает возможность определить хромосомные заболевания

насл. дефекты обмена определяются б/х анализом амниотической жидкости. В случае выявления аномального плода возможно его абортирование, либо лечение внутриутробно или сразу после рождения.

Просеивающие программы (скрининг). Скрининг означает выявление болезни или дефекта развития с помощью тестов, обследований или процедур, дающих быстрый ответ. Основная цель скрининга — ранее выявление заболевания. В настоящее время более 20 заболеваний можно выявить с помощью скрининга, например: ФКУ, дефекты обмена, анемии, дефекты зрения, слуха, поведения, отклонения в росте, синдром Дауна, дефекты нервной трубки и др. ДНТ — к этой группе относятся анэнцефалия и Анэнцефалия — это отсутствие части головного мозга, костей черепа и мягких тканей. Частота встречаемости 1 на 1000 новорожденных. Дети с анэнцефалией погибают вскоре после рождения вследствие дыхательных расстройств или присоединения инфекции.

Spina bifita — это не закрытие позвоночного канала с отсутствием отдельных частей позвонков, в области дефекта спинной мозг деформирован и оказывается открытым или расположенным непосредственно под кожей. Патология встречается у 1 из 1000 новорожденных, а скрытый дефект лишь одного позвонка — примерно у каждого десятого человека. Прогноз для жизни зависит от протяженности дефекта позвоночника, наличия спинномозговых грыж.

Цитогенетическое изучение хромосом человека начали проводить с начала 20-х гг. XX в. Полученные данные позволили разработать и использовать цитогенетический метод при исследовании и диагностике наследственных болезней.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании кариотипа с применением тех или иных способов окрашивания хромосом. Данный метод позволяет проанализировать хромосомный комплекс клеток человека, установить структурные особенности отдельных хромосом, а также выявить нарушения числа и строения хромосом у исследуемого индивидуума. Наличие связи между обнаруженными нарушениями и появлением определенных патологических признаков в фенотипе человека дает возможность диагностировать различные хромосомные заболевания. Помимо диагностики хромосомных наследственных болезней человека, этот метод применяется при изучении закономерностей мутационного процесса и хромосомного полиморфизма человеческих популяций, а также при составлении генетических карт.

Для проведения исследования можно использовать любые ядер- ные клетки, способные к делению (наиболее удобным объектом являются лимфоциты, выделенные из периферической крови), поскольку с помощью световой микроскопии обнаружить и исследовать хромосомы можно лишь во время митотического деления соматических клеток (предпочтительно в метафазе митоза). Необходимый объем периферической крови пациента для анализа - 1-2 мл.

Анализ кариотипа проводят в несколько этапов:

? культивирование клеток на питательной среде с добавлением ФГА (фитогемагглютинина), стимулирующего митотическое деление клеток, в течение 72 часов;
? добавление в среду колхицина, разрушающего нити веретена деления, с целью остановки митоза на стадии метафазы;
? обработка гипотоническим раствором хлорида натрия для разрушения мембранных структур клетки;
? фиксация хромосом на предметном стекле;
? окрашивание хромосом.

Методы окрашивания хромосом: сплошная окраска красителем Романовского - Гимзы (рутинный метод), дифференциальное окрашивание.

После приготовления препарата и окраски хромосом их исследуют с помощью микроскопа. Обнаруженные митотически делящиеся клетки фотографируют для последующего анализа и систематизации.

В результате проделанной работы может быть составлена карио- грамма исследуемого человека в соответствии с международной классификацией.

Рутинный метод окрашивания позволяет относительно легко отнести ту или иную пару гомологичных хромосом к соответствующей группе. Однако использование данного метода, обеспечивающего интенсивное равномерное окрашивание каждой хромосомы, малоинформативно при идентификации хромосом и изучении структурных перестроек.

Более сложные методы - методы дифференциального окрашивания хромосом, условно обозначенные как R-, G-, Q-, С-методы, и способ дифференциального окрашивания хроматид бромдезоксиуриди- ном, при которых окраска распределяется не равномерно по всей длине исследуемой структуры, а в виде отдельных сегментов. Для каждой пары хромосом характерен собственный специфический характер чередования поперечных полос, поэтому дифференциальное окрашивание позволяет выявлять как численные, так и структурные аномалии кариотипа, а также идентифицировать каждую хромосому.

Наиболее часто применяется относительно простой метод окраски по Гимзе (G-окрашивание), который не требует использования флюоресцентного микроскопа. При Q-окрашивании флюоресцентным красителем (акрихином, акрихин-ипритом), с помощью ультрафиолетового излучения, можно дифференцировать Y-хромосому. Характер сегментированности хромосом при Q- и G-окрашиваниях обычно является сходным. При использовании флюорохромов для R-окрашива- ния удается четко определять концевые (теломерные) районы хромосом, при этом картина чередующихся окрашенных и светлых сегментов будет обратной по сравнению с той, которую наблюдают при G- и Q-окрашивании. Для установления локализации околоцентромерно- го и других участков гетерохроматина также применяется специальное окрашивание - С-окрашивание, позволяющее выявлять соответствующий хромосомный полиморфизм. С помощью окраски бромдезокси- уридином можно обнаружить сестринские хроматидные обмены.

Для изучения структурных повреждений каждое плечо окрашенной хромосомы подразделяют на районы, нумерация которых осуществляется в направлении от центромеры к теломере. Отдельные плечи разных хромосом имеют от одного до четырех таких районов. Внутри района выделяют сегменты с разной интенсивностью окраски, которые нумеруются по порядку в указанном выше направлении. Так, символическая запись 1р36 означает, что имеется в виду шестой сегмент третьего района короткого плеча первой хромосомы.

Таким образом, дифференциальное окрашивание позволяет не только достаточно точно выявить утрату или добавление отдельной хромосомы либо ее фрагмента, но и определить от кого из родителей была получена лишняя или мутантная хромосома после дополнительного изучения кариотипа родителей.

Цитогенетический метод с использованием полной схемы карио- типирования применяется как один из обязательных диагностических тестов в следующих случаях:

1) при обследовании детей с врожденными пороками развития;
2) обследовании женщин, у которых наблюдались привычные выкидыши или мертворожденна;
3) проведении дородовой диагностики наследственных заболеваний в случае пожилого возраста матери либо предполагаемого наследования в семье структурных нарушений отдельных хромосом (небольших делеций, транслокаций и др.);
4) для подтверждения диагноза хромосомной патологии, поставленного на основании исследования полового хроматина.

В тех случаях, когда нарушения в кариотипе человека касаются изменения числа половых хромосом, наряду с полным кариотипирова- нием возможно также проведение значительно более простых цитогенетических исследований, связанных с обнаружением тельца полового хроматина в интерфазных ядрах соматических клеток человека. Половой хроматин (Х-хроматин, или тельце Барра) представляет собой одну из двух Х-хромосом индивидуумов женского пола, которая в норме инактивируется (гетерохроматинизируется) уже в раннем периоде эмбрионального развития.

Наиболее простой и быстрый по времени метод определения полового хроматина связан с окраской ацеторсеином клеток слизистой оболочки полости рта, полученных путем соскоба с внутренней поверхности щеки при помощи шпателя. Материал соскоба распределяют по поверхности предметного стекла и на 1-2 мин наносят краситель. Затем покрывают препарат покровным стеклом и, слегка нажимая на него, удаляют остаток красителя фильтровальной бумагой. Окрашенный препарат изучают с помощью светового микроскопа с иммерсионным объективом. При этом половой хроматин выявляется под ядерной оболочкой клетки в виде плотного образования (тельца) различной формы, чаще всего овальной или треугольной (рис. 7.4).

В норме половой хроматин обнаруживается в ядрах большинства клеток (50-70%) у лиц женского пола, тогда как у индивидуумов мужского пола он встречается очень редко (0-5% всех клеток). При изменении

Рис. 7.4.

числа Х-хромосом в кариотипе индивидуума меняется и содержание полового хроматина в его клетках. Связь между количеством Х-хромосом (N) и числом телец полового хроматина (п) можно выразить в виде формулы п = N - 1. Так, в клетках женщин с синдромом Шерешевского - Тернера (моносомия X, кариотип 45,X) ядра не содержат полового хроматина, тогда как в случае трисомии X (47,XXX) в ядрах большинства клеток обнаруживаются два тельца полового хроматина (см. рис. 7.4).

Определение содержания Х-хроматина в клетках человека в клинической практике обычно проводят в следующих ситуациях:

? при цитологической диагностике пола в случаях его реверсии (гермафродитизм);
? с целью установления пола будущего ребенка в процессе дородовой диагностики (при высоком риске заболевания, сцепленного с полом);
? для предварительной диагностики наследственных заболеваний, связанных с нарушением числа половых хромосом.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. При изучении фотокопии хромосомного комплекса человека были проведены измерения и определены следующие относительные размеры короткого (р) и длинного (q) плеча отдельных хромосом (р / q):
- ? 3,1/4,9;
- ? 1,7/4,3;
- ? 1,7/3,3;
- ? 0,6/3,0;
- ? 1,2/2,1;
- ? 0,6/1,4.

Рассчитайте центромерный индекс (в %) для каждой из указанных выше хромосом исследуемого кариотипа по формуле р / (р + q).

2. Сделайте заключение о возможном кариотипе индивидуума, имеющего следующие особенности:
- ? фенотип женский, более 50% соматических клеток имеют одно тельце полового хроматина;
- ? фенотип женский, менее 5% клеток имеют одно тельце полового хроматина;
- ? фенотип женский, более 50% клеток имеют два тельца полового хроматина;
- ? фенотип мужской, менее 5% клеток имеют одно тельце хроматина;
- ? фенотип мужской, более 50% клеток имеют одно тельце полового хроматина;
- ? фенотип мужской, более 50% клеток имеют два тельца Барра.
3. Определите, какое число телец полового хроматина можно обнаружить в большинстве интерфазных ядер людей со следующими кариотипами: 46,XX, 46,XY, 47.XXY, 48.XXXY, 45,X, 47,XXX, 48.ХХХХ, 49.ХХХХХ.
4. У фенотипически мужского организма проведено определение полового хроматина в клетках слизистой оболочки щеки. Укажите, при каком уровне содержания хроматина можно подозревать патологию: 0%, 60%, 2,5%.
5. Внесите информацию в незаполненные колонки таблицы, обозначив (знаком

Для качественной своевременной диагностики врожденных заболеваний, предрасположенности к онкологическим патологиям используется цитогенетическое исследование.

С помощью современных методик и новейшего оборудования изучается хромосомный набор плода.

Найденные аномалии в хромосомном аппарате позволят выявить и предотвратить возможные патологии еще до рождения ребенка.

Данная процедура отличается сложностью и многоступенчатостью, поэтому для решения каждой отдельной диагностической задачи требуется свое цитогенетическое специализированное обследование.

Цитогенетическое исследование изучает связи между наследственными факторами и ядерными структурами соматических клеток человека.

Данные методы анализа широко используются в биологии и медицине для определения происхождения, эволюции, изменчивости живых существ на протяжении филогенеза и онтогенеза.

Особое внимание уделяется индивидуальным генетическим особенностям. Именно поэтому главным предметом, с которым работает цитогенетический метод исследования, является хромосомный набор человека, животных и растений.

Изменения в хромосомах, передаваясь по наследству, определяют признаки организма, его подверженность различным заболеваниям, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды.

Именно хромосомы определяют передачу некоторых заболеваний, поэтому по их набору и структурным изменениям можно увидеть предрасположенность конкретного человека к развитию онкологических и других тяжелых болезней.

Разнообразные структурные перестройки хромосом, аномалии хромосомного набора выявляет цитогенетический анализ и исследование.

Такие методики применяются для современной диагностики опасных заболеваний на начальных стадиях их развития.

На ранних стадиях беременности применение цитогенетического исследования хромосом плода позволяет определить пол будущего ребенка на клеточном уровне.

Высокотехнологичное оборудование последнего поколения, проверенные методики исследования позволяют обнаруживать и предотвращать онкологические заболевания и генетические патологии.

Точная диагностика дает возможность определить наиболее оптимальную тактику лечения, которая будет способствовать положительному терапевтическому результату.

Успешность такой процедуры зависит от качества, точности оборудования, квалификации, опыта медицинского персонала.

Точные данные анализа хромосом определяют успешность всего последующего лечения, поэтому необходимо стараться с первого раза получить правильные результаты.

Иногда данный вид диагностики оказывается единственно возможным. Эта технология исследования позволяет создать большое количество копий ДНК, которые исследуются различными способами, повышая достоверность результатов.

Выявленная на ранних стадиях болезнь лечится намного легче, а эффективная быстрая терапия зачастую спасает жизнь.

Исследование кариотип

Хромосомный набор (кариотип) изучается несколькими способами, которые используют различный биологический материал для анализов.

Исследование кариотип чаще всего работает с венозной кровью, которая смешивается в пробирке с литием и гепарином.

Забор крови производится в количестве 2 мл, после чего она содержится внутри питательной среды на протяжении 3 суток. Только после этого полученный материал фиксируется и исследуется под микроскопом.

За месяц до анализа хромосом следует отказаться от приема антибиотиков, кроме того, такие процедуры не проводятся при простудных заболеваниях.

Исследования кариотипа (кариотипирование) анализирует с помощью методики световой микроскопии форму, размер, число хромосом, используя специальное окрашивание. Нормальные показатели у мужчин обозначаются 46,XY, а у женщин – 46,XX.

Кариотипирование исследует структурные аномалии генетического материала, которые связаны с разрывами хромосом. Эти разрушения компенсируются с помощью различных нездоровых аномальных комбинаций.

С развитием современной медицинской техники появляются новые цитогенетические методики исследования, которые эффективно идентифицируют такие патологические изменения хромосом.

Если существуют подозрения на генетические отклонения в развитии эмбриона человека, то отдельно производится цитологический анализ плода.

Современные медицинские центры с хорошим оборудованием и квалифицированным персоналом выявляют различные пороки развития, хромосомные болезни, с достаточно высокой точностью определяют возможности благополучно выносить ребенка.

Если есть подозрения на онкологические заболевания органов системы кроветворения, то назначается цитологическое исследование костного мозга.

Такие анализы проводятся только в медицинских учреждениях, которые имеют специальное оборудование и квалифицированный персонал.

Это вызвано тем, что забор биологического материала для анализа и исследования связан с опасностью для здоровья и жизни.

С целью исключения хромосомных заболеваний плода на 3-4 месяце беременности проводится анализ хориона, который исследует не менее 20 клеток системы кроветворения.

Такое тестирование поможет предвидеть такие патологии, как болезнь Хантера, синдром Дауна и многие другие заболевания.

Изменение набора хромосом при онкологических процессах может быть использовано для ранней диагностики рака, поэтому диагностические исследования на цитологическом уровне активно развиваются с ростом технического прогресса.

Задачи анализа кариотипа и его виды

Подробное изучение кариотипа проводится для решения следующих конкретных задач:

уточнения диагностического основания для назначения оптимального лечения онкологических заболеваний;
выявления причины врожденных заболеваний ребенка на генетическом уровне;
нахождение генетических причин выкидыша, женского бесплодия;
выявление последствий воздействия вредных факторов на работе;
обнаружения аномальных хромосом у плода.

Таким образом, показаниями к проведению подобного анализа являются бесплодие, прерывание беременности, подозрение на хромосомные патологии, отсутствие менструаций у женщин половозрелого возраста, нарушения и задержки полового развития.

Хромосомные аномалии у плода нередко могут становиться причиной неразвивающейся беременности.

В зависимости от уровней проведения анализ кариотипа бывает двух видов:

обычным;
молекулярным.

Если нарушение нормального кариотипа происходит на ранних стадиях полового развития человека, то при слиянии половых клеток и образовании зиготы такие аномалии сохраняются.

В дальнейшем развитии эмбрион сохраняет патологические неправильные хромосомы. Такое положение приводит к патологическим изменениям индивидуального развития, которые нередко оказываются нежизнеспособными.

Однако бывает положение, когда изначально при делении зиготы развивается несколько линий делений клеток, которые имеют разные кариотипы. Это позволяют выявить обычные цитогенетические методы исследования.

Молекулярное кариотипирование является самым современным методом исследования генома человека. С помощью такого анализа появилась возможность выявлять различные вариации числа копий генов.

Такие патологии характеризуются потерями участков молекул ДНК, которые содержат важную генетическую информацию. Все это приводит к умственной отсталости, эпилепсии, раку, аутизму.

С помощью этого метода можно достаточно точно определить гены, которые находятся в области перестройки, выяснить их непрямой или непосредственный вклад на развитие генетических заболеваний.

На сегодняшний день этот метод является важнейшим инструментом для постановки точного диагноза большинства генетических патологий.

Процедура кариотипирования

Набор внутри соматических клеток организма, состоящий из 23 пар хромосом, одна из которых передается от матери, а другая – от отца, представляет собой кариотип человека.

Для проведения анализа кариотипа используются любые клетки, которые могут быть получены из крови, костного мозга, эпителия человека.

На протяжении клеточного цикла внешний вид хромосом значительно меняется. На одних стадиях митоза они располагаются внутри ядра, не имеют спиральной формы, а на других образуется спиральная структура большего размера.

Наиболее подходящий для внешнего наблюдения этап клеточного деления – метафаза. Именно на этой стадии можно проводить микроскопическое исследование хромосом.

Исследовательская процедура проводится в следующем порядке:

Митоз останавливается на стадии метафазы и с помощью добавления колхицина, который фиксирует незаконченный процесс деления клеток, выделенная клеточная структура обогащается;
Такие клетки окрашиваются, фиксируются, после чего их фотографируют под микроскопом;
Полученные фотографии гомологичных хромосом систематизируются и выкладываются в определенном порядке.

С появлением методов дифференциальной окраски хромосом стала возможна их более подробная детализация при микроскопическом исследовании. Со временем эта методология совершенствовалась и развивалась.

Сдать анализ на определение кариотипа можно во многих специализированных клиниках. При этом такая процедура может проводиться в двух вариантах.

В первом случае анализируются количественные и структурные изменения хромосом, полученных от родителей.

Во втором анализируются внутренние мутации хромосом под влиянием неблагоприятных внешних факторов.

Нередко кариотипирование назначается супругам для определения причин бесплодия. При этом сдача биологического материала на анализ может происходить в разное время.

Таким образом, анализ кариотипов имеет большое значение в медицине, поскольку позволяет определять хромосомные перестройки, нарушения их структуры и порядка.

Цитогенетические обследования диагностируют ряд генетических заболеваний, которые напрямую связаны с хромосомами.

Метод микроскопического изучения наследственных структур клетки - хромосом. Он включает кариотипирование и определение полового хроматина.

а) Кариотипирование проводится для получения метафазных хромосом.

Кариотип - это диплоидный набор хромосом в соматических клетках на стадии метафазы, характерный для данного вида.

Кариотип, представленный в виде диаграммы, называется идиограмма, кариограмма или хромосомный комплекс.

Для кариотипирования наиболее удобным источником клеток являются лимфоциты (клетки периферической крови). Вначале получают достаточное количество делящихся клеток (стимуляция ФГА), а затем метафазные пластинки (для остановки деления на стадии метафазы используют колхицин) с раздельно лежащими хромосомами (гипотонический раствор). Препараты окрашивают и фотографируют, хромосомы вырезают и раскладывают.

Для систематизации хромосом используют две стандартные классификации: Денверскую и Парижскую. В основу Денверской классификации положены два принципа: длина хромосом и их форма (метацентрические, субметацентрические, акроцентрические), при этом используется метод сплошной окраски хромосом. По этой классификации все хромосомы разделены на семь групп, каждая пара хромосом имеет свой номер. Недостатком классификации является трудность в идентификации хромосом внутри группы.

Парижская классификация основывается на дифференциальном окрашивании метафазных хромосом. Каждая хромосома имеет свой индивидуальный рисунок, четкую дифференциацию по длине на светлые и темные полосы - диски (сегменты). Разработана система обозначения линейной дифференциации хромосом (номер хромосомы, плечо, район, сегмент).

б) Определение Х-полового хроматина.

Половой хроматин (тельце Барра) - компактная темная глыбка, которая имеется в интерфазном ядре соматических клеток нормальных женщин. Половой хроматин представляет спирализованную Х-хромосому. Инактивация одной из Х-хромосом является механизмом, выравнивающим баланс генов в мужском и женском организме. Согласно гипотезе Марии Лайон, инактивация Х-хромосомы происходит на ранних стадиях эмбриогенеза (14 день), она носит случайный характер, причем инактивируются только длинные плечи Х-хромосомы. По числу глыбок полового хроматина можно судить о числе Х-хромосом (формула n+1, где n - число телец Барра). При любом числе Х-хромосом в активном состоянии будет только одна Х-хромосома. Цитогенетические методы используются для диагностики хромосомных болезней (изменение числа и структуры хромосом), определения пола, изучения хромосомного полиморфизма членов популяций.

Цитогенетический метод применяют в целях:

изучения кариотипа человека

диагностики хромосомных заболеваний

изучения мутагенного действия различных веществ при генных и хромосомных мутациях

составлении генетических карт хромосом

Этапы:

1. Культивирование клеток крови на питательных средах

2. Стимуляция митотических делений

3. Добавление колхицина для разрушения нитей веретена деления, остановка деления на стадии метафазы

4. Обработка клеток гипотоническим раствором для свободного расположения хромосом

5. Окрашивание

6. Микроскопирование и фотографирование

7. Построение идиограммы

Омская Государственная Медицинская Академия

Кафедра пропедевтики детских болезней и поликлинической педиатрии

Утверждаю:

Зав. кафедрой Лукьянов А.В.

“_____” 20__ г.

Медицинская генетика

Методы медицинской генетики – цитогенетический

ОМСК – 2001

УТВЕРЖДАЮ

Зав. кафедрой

“___” 20___ г.

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА к практическому занятию для студентов IV курса педиатрического факультета

Тема занятия : Методы медицинской генетики – Цитогенетический

Актуальность темы : Значительная часть множественных врожденных пороков развития, нарушений полового и психомоторного развития у детей связана с изменениями числа или структуры хромосом. Успехи в выделении самостоятельных хромосомных синдромов, в их диагностике в каждом конкретном случае, а также профилактике и лечении невозможны без изучения структуры и функций хромосом, основных методов их исследования.

Цель занятия : Изучить строение и классификацию хромосом человека, основные методы исследования – кариотипирование и анализ полового хроматина. Определить основные синдромы, причиной которых являются хромосомные аномалии и показания для цитогенетического метода исследования.

Студент должен знать:

Строение, функцию и классификацию хромосом человека (биология).

Числовые и структурные аномалии хромосом.

Полиморфизм хромосомных синдромов (патофизиология).

Методы цитогенетического исследования (биология).

Студент должен уметь:

Выявить фенотипические признаки хромосомных синдромов у детей.

Определить показания для исследования кариотипа и полового хроматина.

Интерпретировать заключения врача–цитогенетика о наличии хромосомной патологии у пробанда.

Оснащение занятия :

таблицы, слайды, фотографии, ситуационные задачи, препараты метафазных пластинок хромосом человека, препараты буккального эпителия, наборы реактивов, световой микроскоп.

Продолжительность занятия : 140 минут

Место проведения занятия : учебная комната, цитогенетическая лаборатория

Методика проведения занятия :

1. Проверка присутствующих 10 мин

2. Формулировка темы 10 мин

3. Решение ситуационных задач 30 мин

4. Обсуждение материала 65 мин

5. Ответы на вопросы 10 мин

6. Заключение преподавателя и задание на дом 10 мин

Реферат

Цитогенетика человека занимает одно из важнейших мест в медицинской генетике. Объектом цитогенетических исследований служа хромосомы (греч. chroma – ‘цвет’ и soma – ‘тело’; В. Вальдеер, 1888 г) – структурные элементы ядра клетки, заключающие в себе основную часть наследственной информации. В зависимости от функциональной активности и стадии клеточного цикла в составе хромосом ДНК может быть уложена с различной плотностью. События, развертывающиеся в клетке в процессе митотического деления протекают в закономерной последовательности и составляют пять сменяющихся стадий: интерфаза, профаза, метафаза, анафаза и телофаза. Митотические хромосомы образуются в клетке во время митоза, ДНК в них уложена чрезвычайно плотно. Благодаря этому обеспечивается равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками при митозе. Интерфазные хромосомы (хроматин) активно участвуют в процессах транскрипции и репликации.

Форма метафазных хромосом определяется положение первичной перетяжки – центромеры, которая делит ее на две равных или неравных по длине плеча – теломеры. Короткое плеча хромосомы обозначают литерой "p ", длинное – "q ". Выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.

Соматические клетки человека имеют постоянный двойной диплоидный (2n ) набор хромосом или кариотип, который составлен из двух одинарных гаплоидных наборов (n ), полученных от родителей. В соматических клетках человека диплоидный набор составляют 46 хромосом (22 пары аутосом и пара половых хромосом). Нормальный набор половых хромосом у женщин представлен ХХ и у мужчин – XY хромосомами. В половых клетках содержится гаплоидный набор хромосом.

Классификация равномерно окрашенных хромосом выработана на международных совещаниях в Денвере (1960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Хромосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все пары аутосом нумеруют арабскими цифрами от 1 до 22. Половые хромосомы обозначают латинскими буквами X и Y и при кариотипировании помещают в конце раскладки. Расположенные в указанном порядке, все аутосомы распределяются на семь групп, которые различаются между собой по длине и форме составляющих их членов и обозначаются буквами английского алфавита от A до G. В группе A (1–3) оказываются три пары самых крупных хромосом: 1, 3 – метацентрические хромосомы и 2 – субметацентрическая. Группа B (4–5) включает 2 пары длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6–12) объединяет семь пар субметацентрических аутосом и не отличающуюся от них Х‑хромосому. В группу D (13–15) входят три пары акроцентрических хромосом, а в группу Е (16–18) – три пары субметацентрических хромосом. Группа F (19–20) содержит две пары маленьких метацентрических хромосом, группа G (21–22) – две пары самых мелких акроцентрических хромосом. Y‑хромосома выделяется как самостоятельная.

С появлением методов дифференциальной окраски (G, Q, C) появилась возможность идентифицировать хромосомы по характерному для каждой пары чередованию светлых (эухроматин) и темных (гетерохроматин) полос, расположенных симметрично в сестринских хроматидах (Париж, 1971).

Каждая хромосома дифференцирована на 2 типа различных районов, так называемые эу- и гетерохроматические районы. Эухроматические, активные районы – содержат весь основной комплекс генов ядра, т.е. участков хромосомной нити, дифференциально контролирующих развитие признаков организма. Гетерохроматические районы образуют дистальные и проксимальные участки хромосомной нити, а также входят в состав внутренних ее частей. Роль гетерохроматических районов хромосом, эволюционно закрепленных в их структуре, в настоящее время активно изучается.

Среди геномных мутаций выделяют:

полиплоидии – увеличение количества хромосом, кратное гаплоидному числу n (3n, 4n и т.д. );

анеуплоидии – отклонение количества хромосом от эуплоидных чисел. Среди анеуплоидий выделяют:

моносомии (2n–1 ) – отсутствие одной хромосомы для соответствующей пары,

трисомии (2n+1 ) – наличие 3‑х гомологичных хромосом вместо обычной пары;

мозаицизм – присутствие более одной популяции клеток с разным числом хромосом у одного и того же человека.

Структурные перестройки могут быть сбалансированными , когда порядок расположения сегментов в хромосомах нарушен, но в целом, количества генетического материала не меняется:

инверсии –поворот участка хромосомы на 180°,

транслокации – обмен участками хромосом; могут быть реципрокными при взаимном обмене участками между двумя негомологичными хромосомами и робертсоновскими – транслокации между двумя акроцентрическими хромосомами.

Несбалансированные перестройки возникают при утрате или избытке хромосомного материала:

делеции – утрата части хромосомы;

дупликации – удвоение участка хромосомы;

изохромосомы – хромосомы, состоящие из двух коротких плечей.

Увеличение или потерю хромосомного материала обозначают соответственно знаком "+" или "–", помещаемым перед номером хромосомы (47 ,XY +21 ).

Методы цитогенетического анализа делятся на прямые и непрямые. Непрямые методы включают в качестве обязательного этапа культивирование клеток в искусственных питательных средах. Материалом являются лимфоциты периферической крови и пуповинной крови плода, фибробласты кожи и амниотической жидкости, клетки спонтанно абортируемых эмбрионов и зародышевых оболочек. Прямые методы применяются в тех случаях, когда необходим быстрый результат и имеется возможность получить препараты хромосом клеток, делящихся в организме. Источником таких клеток является костный мозг и клетки зародышевых оболочек. Основным объектом цитогенетического исследования прямыми и непрямыми методами являются стадия метафазы митоза и различные стадии мейоза. Метафаза митоза служит основным объектом для анализа хромосомного набора, т.к. именно на этой стадии возможна точная идентификация хромосом и выявление их аномалий.

Во время митоза каждая хромосома состоит из двух одинаково длинных тонких тяжей, называемых сестринскими хроматидами, сжимающихся в плотные структуры, в связи с чем создается впечатление коротких плечей, поддерживающихся вместе с помощью центромеры. В метафазе, когда их длина самая наибольшая, хромосомы разбиваются на пары. Подобная систематизация хромосом из одной клетки называется кариотипом. При лабораторных исследованиях у каждого пациента анализируется 10–40 метафазных кариотипов. При подозрении на мозаицизм необходимо анализировать как большее число клеток, так и клетки других тканей.

Показания для исследования кариотипа пробанда

Множественные врожденные пороки развития и микроаномалии у новорожденных детей и их родителей.

Олигофрения, задержка физического и нервно-психического развития в сочетании с врожденными аномалиями.

Нарушение дифференцировки пола.

Первичная и вторичная аменорея.

Бесплодие.

Женщины со спонтанными абортами, привычными самопроизвольными абортами, мертворождением.

У родственников пробанда первой степени родства, который имеет структурные перестройки хромосом.

Для выявления изменений в системе половых хромосом используются следующие экспресс–методы :

Определение полового Х‑хроматина в интерфазных ядрах клеток буккального эпителия. Каждая клетка содержит только одну генетически активную Х‑хромосому. Цитологическим проявлением неактивной Х‑хромосомы служит хроматиновая масса (тельце Барра), обнаруживаемая на периферии интерфазного ядра. По количеству телец Барра можно судить о количестве неактивных Х‑хромосом. Например, в используемых клетках женского организма (46,ХХ ), при синдроме Клайнфельтера определяется 1 тельце Барра. В клетках мужского организма и в большинстве эпителиальных клеток при синдроме Тернера (45,Х0 ) половой Х‑хроматин отсутствует. Существует эмпирическое правило, согласно которому число телец полового хроматина равно числу Х‑хромосом минус 1 (В=Х–1 ).

Определение Y ‑хроматина . В интерфазном ядре при окраске люминесцентными красителями (Q–метод) Y‑хромосома выглядит ярко флюоресцирующим скоплением хроматина. Пробы на Х- и Y‑хроматин не должны служить в качестве абсолютно достоверных для диагностики при патологическом изменении половых хромосом. Окончательный ответ может быть получен только при анализе кариотипа пациента.

Показания для исследования полового хроматина

Нарушение половой дифференцировки.

Подозрение на синдромы Шерешевского–Тернера, Клайнфельтера.

Аменорея.

Бесплодие.

Внутриутробное определение пола при Х–сцепленных заболеваниях.

Клинический полиморфизм хромосомных синдромов обусловлен различными аномалиями аутосом и половых хромосом. При хромосомных синдромах отмечается резкий дисбаланс генов, но общее влияние генома создает полиморфизм клинических признаков.

Особенности проявления аутосомной патологии

Характеризуется множественными врожденными пороками развития.

Сопровождается грубым дефектом интеллекта или резкой задержкой психомоторного развития.

Продолжительность жизни больных не значительна.

Диагностика данной патологии возможна с рождения.

Среди числовых аномалий аутосом возможно рождение детей с трисомией 21 хромосомы (синдром Дауна), 13 хромосомы (синдром Патау), 18 хромосомы (синдром Эдвардса), реже встречаются трисомии 8 и 9 хромосом. Трисомия по группам А и В хромосом среди живорожденных не описана.

Среди несбалансированных структурных аномалий возможно рождение детей с синдромами частичной моносомии, например синдром кошачьего крика (делеция короткого плеча 5 хромосомы), синдром Вольфа–Хиршкорна (делеция короткого плеча 4 хромосомы), синдром Арбели (делеция короткого плеча 13 хромосомы), синдром Лежена (делеция короткого плеча 18 хромосомы). Случаем частичной моносомии являются кольцевые хромосомы. Возможна частичная трисомия 6–11 хромосом.

Особенности проявления патологии половых хромосом

Характерно изолированное поражение внутренних органов и микроаномалии.

Интеллект снижен незначительно.

Продолжительность жизни обычная.

Среди числовых аномалий половых хромосом с наибольшей частотой встречаются моносомия Х‑хромосомы (45,Х0 – типичная форма синдрома Шерешевского–Тернера), трисомия Х‑хромосомы у женщин (47,ХХХ ) и дисомия у мужчин (47, XXY – синдром Клайнфельтера), возможна дисомия Y‑хромосомы (47, XYY ).

Из структурных аномалий возможно обнаружение в кариотипе Х‑изохромосомы, состоящей из двух длинных плеч (46, Xi (Xq )), делеции Х‑хромосомы (46, Xdel (X ) (q11 )), кольцевых Х‑хромосом (46, Х , r (Х )).

В большинстве случаев хромосомные аномалии носят спорадический характер, т.е. возникают в виде новой мутации при нормальном кариотипе обоих родителей пробанда. В таких случаях риск для сибсов оценивается по эмпирическим данным для каждого типа аномалий с учетом возраста матери. Риск выше при носительстве сбалансированной перестройки у матери, чем у отца. В ряде случаев при обследовании родителей пробанда у кого-либо из них обнаруживается мозаицизм, т.е. часть клеток имеет такой же аномальный кариотип, как у пробанда. Риск для сибсов рассчитывается по формуле:

х	×К
2–х

где х – доля аномального клеточного клона, К – коэффициент элиминации несбалансированных зигот в эмбриогенезе (при синдроме Дауна К=½).

В настоящее время существуют различные схемы лечения целого ряда хромосомных синдромов, включающие гормональную терапию и хирургическую коррекцию дефектов. Важным для профилактики рождения детей с хромосомными синдромами является генетическое консультирование семьи, исследование кариотипа родителей, расчет риска повторного рождения ребенка с хромосомной патологией, использование комплекса прямых методов пренатальной диагностики (ультразвуковое сканирование плода, исследование альфа–фетопротеина, амниоцентез, хорионбиопсия, кордоцентез и др.) для решения вопроса о целесообразности сохранения заведомо неперспективной беременности.

Частота фенотипических признаков при синдроме Шерешевского–Тернера к периоду полового созревания (регулярная и мозаичные формы)

Признаки	Частота (%)
1. Низкий рост
2. "Щитовидная" грудная клетка
3. Широко расставленные соски
4. Деформация тела грудины
5. Тестоватый тургор тканей
6. Антимонголоидный разрез глаз
7. Эпикант
8. Деформация ушных раковин
9. Крыловидная складка на шее
10. Лимфатические отеки
11. Олигофрения
12. Первичная аменорея
13. Сахарный диабет
14. Обилие пигментных пятен

16. Аркообразное небо
17. Низкий рост волос на шее
18. Гипоплазия или аномальное строение наружных гениталий
19. Врожденные аномалии мочевыводящей системы
20. Врожденные пороки сердца
21. Аномалии скелета